کروماتوگرافی مایع یک تکنیک جداسازی است که در آن فاز متحرک مایع است.کروماتوگرافی مایع را می توان در یک ستون یا صفحه انجام داد. کروماتوگرافی مایعی که امروزه انجام می شود معمولا از ذرات packing بسیار کوچک و یک فشار نسبتا بالا استفاده می کند و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) نامیده می شود. کروماتوگرافی فرآیندی برای جداسازی اجزای نمونه براساس تفاوت در میل ترکیبی آنها با دو محیط مختلف به نام فاز متحرک و فاز ایستا است. فاز متحرک یا حلال شستشو،گاز یا مایعی است که از داخل فاز ایستا (جاذب) می گذرد. فاز ایستا به نحوی پیکربندی می شود که اجزای نمونه به سطح آن بچسبند. در این فاز یا مایع ترکیب شده یا جامد (معمولا سیلیس یا پلیمرهای آلی) است یا مایعی است که فاز متحرک با یک پمپ در فشار بالا از درون آن عبور میکند. اجزای نمونه که حل پذیری بیشتری در حلال یا میل ترکیبی کمتری به جاذب دارند سریع تر حرکت کرده و مسافت بیشتری به جلو می روند.
کروماتوگرافی مايع يكی از انواع كروماتوگرافی است كه فاز متحرك در آن مايع است كه 4 نوع اصلی آن عبارتند از :
1- كروماتوگرافي تقسيمی (Partition Chromatography)
2- كروماتوگرافي جذب سطحی (Adsorption Chromatography)
3- كروماتوگرافي تبادل يونی (Ion-Exchange Chromatography)
4- كروماتوگرافي اندازه طردی (Size Exclusion Chromatography)
اجزاء و قسمت‌های مختلف دستگاه HPLC
یک دستگاه HPLC معمولا تشکیل شده از:
1- مخازن حلال: که در آنها فاز متحرک و یا حلال‌های شستشودهنده ستون ریخته شده است.
2- موتور یا پمپ: پمپ HPLC می تواند در مود isocratic یا مود گرادیان عمل میکند. در مود isocratic از یک فاز متحرک در کل اجزا استفاده می شود و معمولا برای ترکیباتی با ساختارهای مشابه استفاده می شود.زیرا در یک زمان منطقی جدا می شوند. مود گرادیان برای نمونه های پیچیده تر و ترکیبی استفاده می شود و می تواند با تغییر ترکیب فاز متحرک در طول اجرای شستشوی چندجزیی را تسریع کند این کار با ترکیب دو یا چند حلال به صورت پله ای یا پیوسته طبق یک برنامه از پیش تعیین شده انجام میشود.
3- تزریق‌کننده (Injector):
انژکتور نمونه به نحوی طراحی شده است که نمونه را به صورت یک slugباریک تزریق کند تا باریک ترین قله را داشته باشیم. در مرسوم ترین نوع انژکتور یعنی دریچه تزریق حلقه ثابت، کسری از نمونه از طریق میکروسرنگ به داخل حلقه خارجی یک لوله استیل ضدزنگ وارد می شود و دریچه می چرخد به نحوی که نمونه با جریان حلال که در کل سیستم در حال گردش است به سرعت به داخل ستون وارد شود. حجم نمونه براساس اندازه و قطر داخلی حلقه نمونه، تعیین می شود لذا برای تغییر حجم نمونه ممکن است نیاز به تغییر حلقه ها باشد.
4- ستون: ستونها حاوی فاز ایستا هستند و مهم ترین بخش سیستم جداسازی هستند. معمولا از استیل ضدزنگ ساخته می شوند و می توانند فشارهای تا 1000psi تحمل کنند. طول آنها بین 10 تا 150 سانتی متر و قطر داخلی آنها بین 2 تا 5 میلی متر است. ستونهای HPLC زمانی که با ذرات متخلخل کوچک (3،5 یا 10 میکرومتری) استفاده می شود بسیار کارا است. برای داشتن ستونهای بسیار کارآمد و فشارهای عملکردی مناسب، اندازه ذرات باید تا حد امکان یکنواخت باشد. ذرات با شکل کروی و نامنظم موجود هستند که ستونهای Packed با این ذرات، عمر طولانی تری داشته و فشارهای پایین تر عمل میکند.
5- آشکارساز (Detector):
الف- آشکارسازهای جذبی: آشکارسازهای جذبی عمومی ترین آشکارساز HPLC به حساب می آیند. اصول کارکرد آن بر این مبناست که فاز متحرک از ستون به درون محفظه ای کوچک جاری می شود. محفظه در مقابل اشعه uv-Vis منتشر شده از دستگاه نورسنج یا طیف سنج قرار می گیرد. این آشکارسازها انتخاب گر بوده و فقط می توانند اجزای نمونه ای که نور مریی/ ماورای بنفش را جذب می کنند، آشکار سازند.
ب-
آشکارساز ضریب شکست: اين آشكارساز بر مبناي اختلاف ضريب شكست جزء نمونه خارج شده از ستون و ضريب شكست فاز متحرك خالص (به عنوان شاهد) بنا نهاده شده است. تا زماني كه مابين جزء نمونه و فاز متحرك اختلاف شكست نور موجود باشد مي توان گفت كه اين آشكارسازها نزديكترين وسيله در HPLC به عنوان آشكارساز جامع می باشند.
ج-
آشکارساز فلورسانس: بسياري از مواد مي توانند نور فرابنفش را جذب كرده و سپس اشعه اي در طول موج بالاتر نشركنند. اين نشر تابش يا سريعا صورت مي گيرد ( فلورسانس) و يا با كمي تاخير (فسفر سانس). موادي كه بطور طبيعي خاصيت فلورسانسي دارند داراي ساختمان حلقوي مزدوج هستند.
د- آشکارساز
الکتروشیمیایی: آشكارسازهاي الكتروشيميايي، هدايت مواد شسته شده را اندازه مي گيرند و يا جريان بوجود آمده توسط اكسايش و احياء جزء نمونه را تعيين مي كنند. در حالت اول جزء نمونه بايد يوني باشد و در حالت دوم جزء نمونه بايد براحتي اكسيد يا احياء گردد. نوع اول را آشكارسازه هدايت سنجي و نوع دوم را آشكارساز آمپرومتري گويند.
ه-
آشکارساز طیف‌سنج جرمی (MS): فرايند يونش الكتروافشانه ای: يونش الكتروافشانه اي با جريان يافتن محلول در طول يك لوله مويين هادي الكتريسيته كه در ولتاژ بالا (چندين كيلو ولت جريان مستقيم) نگه داشته شده است، صورت مي پذيرد. محلول خروجي از لوله مويين تبخير مي شود. انفجار كولمبي زماني به وقوع مي پيوندد كه دافعه بين بارها بر كشش سطحي محلول (نگه داشتن قطرات به همديگر) غلبه يابد.
در
صورتیکه از هیچ کدام از این موارد نتوان استفاده کرد، از مشتق‌سازی (ایجاد
تغییرات شیمیایی روی نمونه) جهت ایجاد نمونه فعال در هر یک از این
آشکارسازهای ذکر شده استفاده میشود. شکل زیر نمایی از یک دستگاه HPLC را
به همراه اجزاء مختلف آن به تصویر کشیده است.
